果膠裂解酶（pectinate lyases，PL）試劑盒說明書
微量法100T/48S
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義
果膠裂解酶（EC4.2.2.10）是果膠酶的重要組成部分，是一種能降解植物細胞壁，導致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶，來源比較廣泛，主要來源于微生物，可用于果汁、果酒的澄清，提高水果出汁率，植物病毒的純化，紙漿的漂白和紡織品的生物精煉，在減少環境污染和降低能源消耗方面具有潛在的應用價值。
測定原理
果膠裂解酶作用于果膠中的α-1,4糖苷鍵，生成在還原端C4和C5之間位置具有不飽和鍵的不飽和寡聚半乳糖醛酸，在235nm處有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器
天平、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體6mL×1瓶，4℃保存。
試劑三：液體6mL×1瓶，4℃保存。
酶液提取
1．組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2．細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 培養液：直接測定。
測定操作表
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對照管 |
測定管 |
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試劑一（μL） |
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120 |
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試劑二（μL） |
120 |
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40℃溫育3min |
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酶液（μL） |
20 |
20 |
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混勻，40℃反應30min |
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試劑三（μL） |
60 |
60 |
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混勻于微量石英比色皿/96孔板（UV板）測定235nm處吸光值A，△A=A測定管-A對照管。 |
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酶活性計算公式
1. 組織中PL活性
（1）按照蛋白濃度計算
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 64.1×△A÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每克組織每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T
= 64.1×△A÷W
2. 細菌、真菌PL活性
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每104個細胞每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/104cell）= △A ÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T
= 64.1×△A÷細胞數量
3. 培養液PL活性
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫升培養液每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/mL）= △A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T
= 64.1×△A
ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數：5200L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，30min
1. 組織中PL活性
（1）按照蛋白濃度計算
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫克蛋白每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 128.2×△A÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每克組織每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T
= 128.2×△A÷W
2. 細菌、真菌PL活性
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每104個細胞每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min/104cell）=△A÷（ε×d）×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T
= 128.2×△A÷細胞數量
3. 培養液PL活性
酶活性定義：在40℃，pH5.5條件下，每毫升培養液每分鐘分解果膠產生1nmol不飽和半乳糖醛酸所需的酶量為一個酶活力單位。
PL活性（nmol/min//mL）= △A÷（ε×d）×V反總÷V樣÷T
= 128.2×△A
ε：不飽和半乳糖醛酸摩爾消光系數：5200L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應總體積，0.2mL；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，30min
掃描二維碼
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資料/datasheet
